动物细胞工程
动物细胞培养 指明“动物”细胞培养
(1)概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。
原理：细胞增殖
(2)动物细胞培养：
①取动物组织块(动物胚胎或幼龄动物的器官或组织)
②机械消化或用胰蛋白酶处理分散成单个细胞(利于细胞与培养液充分接触，进而吸收氧气和营养物质并排出废物)
③制成细胞悬液→转入细胞培养瓶/卡式瓶中进行原代培养
——细胞间相互依存，呈现一定程度的组织特性，保持生长分裂、接触抑制、衰老死亡
④贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理使贴壁细胞从瓶壁上脱落下来并分散成单个细胞稀释分装传代培养(最初的若干次传代也归入原代培养)
——大多数细胞最终衰老、凋亡(①营养物质耗尽②遗传物质没变，衰老凋亡)
动物组织培养：动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或生长特性
——可伴随组织分化，但主要的生命活动仍以细胞为单位;由于细胞运动变化， 培养物组分发生变异，长期培养最终成为简单的细胞培养
(3)细胞贴壁和接触抑制
(4)动物细胞培养条件(液体培养基)
①无菌无毒：培养液和用具无菌处理，一定量的抗生素(种、量)，定期更换培养液
②营养：水无机盐、葡萄糖、氨基酸、维生素、动物(胎牛)血清、滋养细胞、激素Cf天然(血清)和人工配制成分
③适宜渗透压、温度、pH(CO2培养箱：维持适宜的pH值～)
提高形成率的措施：
①选择适宜的培养基和CO2、pH
②胰岛素等激素刺激
③添加血清
④滋养细胞支持生长(经射线照射本身失去增殖力的小鼠成纤维细胞)
(5)细胞系：可连续传代的细胞(首次传代细胞即成为细胞系)
①连续细胞系 异倍体 恶性(致癌)/不死性(保留接触抑制，不致癌)
②有限细胞系 二倍体细胞
——传代培养的原因：
①细胞密度过大
②代谢消耗引起营养枯竭
细胞株：特殊的细胞系
(6)细胞克隆/克隆培养法：
定义：把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体
特点：细胞群体来自于同一个细胞(否则具有异质性)，遗传性状均一，表达性状相似
要求：
①最基本：分离出来的细胞是一个而非多个
②一般选择连续细胞系：对培养环境有较大适应范围并具有较强独立生存能力
用途：从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系
动物体细胞核移植技术和克隆动物
动物难以克隆的根本原因：
细胞分化过程中细胞质中的调节蛋白关闭了核中与个体发育有关的基因，使基因选择性表达，基因组中基因活动不完全
(1)原理：动物细胞核的全能性
(2)供核细胞：优良动物的传代培养10代以内的细胞
——后代性别由核供体动物个体的性别决定
受体细胞：去核的MII中期的卵母细胞
①细胞较大，容易操作
②细胞质营养丰富，具有调控细胞核发育、促进核基因表达的物质
(3)体细胞核移植的大致过程是：显微操作去核法
——多莉羊的成功说明：
①高度分化细胞经过一定技术处理，也可以回复到类似受精卵时期的功能
②在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细胞核发育的作用
——无法培育出性状完全相同的克隆动物的原因：
①受体细胞的细胞质基因控制性状表达
②细胞分裂中基因突变
③环境因素
动物细胞融合
(一)克隆
克隆clone：
无性繁殖系(只由一个模板分子、母细胞或母体直接形成新一代…)
克隆技术cloning：
从众多基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择获得目的基因或特定类型细胞的操作技术
内容：
(1)分子水平：基因克隆即目的基因的复制(受体细胞的无性繁殖)、分离(特定基因探针选择、钓取目的基因)过程
(2)细胞水平：杂交瘤制备单克隆抗体
(3)个体水平：
不通过两性细胞的结合，从一个单一(体)细胞繁殖出生物个体
——胚胎细胞克隆以胚胎/卵细胞作为供体、利用核移植，不是严格意义上的动物个体克隆
条件：
(1)理论条件：细胞全能性/有发育成完整新个体的全套遗传物质(根本原因)
(2)基本条件：
①具有包含物种完整基因组的细胞核的活细胞
②具有能有效调控细胞核发育的细胞质物质 去核卵细胞
③完成胚胎发育的必要的环境条件 胚胎早期培养环境/子宫
非正面影响：丰富生物多样性，促进生物进化，维护生态平衡
(二)植物克隆
全能性表达的难易程度：
(1)受精卵>生殖细胞>胚胎/全能干细胞>多能(干)细胞>专能(干)细胞>体细胞;
PS生殖细胞在一定刺激下染色体可加倍;一些动物存在孤雌生殖
(2)植物细胞>动物细胞;低等动物>高等动物
PS不同种类植物或同种植物的不同基因型个体间全能性的表达程度大不相同
植物组织培养(植物克隆的技术基础)
(1)理论基础：植物细胞全能性，即植物体的每个生活细胞都具有遗传上的全能性，因而都具有发育成完整植株的潜能
(2)过程：
①离体植物细胞、组织或器官(外植体)→获得愈伤组织→诱导形成试管苗→新植株
PS外植体选取形成层(分生组织)部分易于诱导形成愈伤组织
培养条件：
首先是离体培养(生物体内细胞中基因在特定时间和空间条件下选择性表达，细胞分化为不同组织、器官，故无法表现出全能性)
半/固体培养基(固体为例)
营养物质：水、无机盐、蔗糖、维生素、有机添加剂(氨基酸、琼脂凝固剂等)
植物激素/生长调节剂(适当浓度配比诱导分化出芽/根的顶端分生组织/花)
——CTK中等量IAA少量诱导脱分化，CTK、IAA比例合适诱导根芽分化
无菌条件(外植体70%酒精消毒、器械高温蒸汽灭菌)——杂菌争夺产毒
适宜的pH、温度和渗透压
光照：若外植体是(带叶)茎段，不经历脱分化再分化，组培全过程均需要光照;
若外植体是非光合作用部位(如胡萝卜块根)，再分化成芽后光照
试管苗移栽前需炼苗(草炭土/蛭石，逐渐降湿)
愈伤组织：排列疏松的高度液泡化的活的薄壁细胞团
②外植体→愈伤组织→摇床液体悬浮培养分散成单细胞→胚状体→人工种子
PS 单细胞植物克隆，类似受精卵的卵裂、分化、器官发生、形态建成
单细胞：细胞质丰富、液泡小、细胞核大(胚性细胞特征)
③酶解细胞壁→原生质体培养→新植株
(2)用途：微型繁殖、制造人工种子(胚状体阶段)、单倍体育种、
作物脱毒(植物分生组织细胞，分裂旺盛病毒极少Cf抗病毒)、在培养基中加入不同浓度的氯化钠溶液，可诱发和筛选抗盐植株
细胞产物工厂化生产(愈伤组织阶段已可，试管培养苗、细胞培养反应器也可)
(3)长期培养后的全能性下降原因：染色体畸变、核变异、非整倍体产生;细胞或组织中激素平衡被打破;细胞对外源生长物质的敏感性改变;形成缺乏成胚性的细胞系
——植株在多次继代培养后，会逐渐丧失细胞全能性的表达能力
原生质体融合/植物体细胞杂交(不同植物)
获得原生质体：在甘露醇溶液环境(较高渗透压)中用纤维素酶和果胶酶混合液处理用网筛过滤原生质体到离心管内，离心后收集沉淀物，用等渗溶液洗涤;检验原生质体是否符合要求：依据渗透作用原理，采用低渗胀破法(见比较表格)
植物细胞工程：培养植物细胞(包括原生质体)，借用基因工程技术将外源DNA导入受体细胞或通过细胞融合将不同源的遗传物质重新组合，再通过细胞培养，获得具有特定性状的植株
C细胞工程：细胞培养和细胞融合(若基因型不同为细胞杂交)
——基因定位：利用细胞杂交中染色体丢失与特定基因产物的对应关系
认真审题
首先需要这些学生认真审题，其次需要这些学生根据题目中考查的知识点联想通过什么样的方法做出这些题目。学生在审题的过程中，需要了解这些题目，考查的知识点有哪些，学生需要学会抓住这些关键词，只有抓住了题目中的关键词，才能够迅速的找到自己，应该通过什么样的方法做题。
找对方法
如果学生在做题的过程中发现有的题目自己不会做。学生应该在平时学习的过程中，记了一些做题的方法。如果不知道考察的是什么内容，学生应该根据这些关键词找出一些方法，排除一些方法之后，学生根据自己的方法做出这些题目。
如果学生想要做对生物题，学生就必须要找对方法。学生在学习的过程中，学生总会积累到一些做题的技巧，通过做大量的练习题，学生能够熟练的应用这些技巧，也能够熟练地应用这些做题的方法。
排除法
有的题目确实需要学生思考一段时间，如果学生觉得在考试的过程中会浪费大量的时间，学生可以通过排除法，找出正确的答案。学生可以直观地同想象中排除一些错误的选项，会剩下几个选项，再根据这些学生的分析，找出正确的答案。其实做生物题也需要一些技巧，就是不会，学生也能够通过正确的方法得出答案。
【微语】茶不求精而壶亦不燥，酒不求洌而樽亦不空；素琴无弦而常调，短笛无腔而自适。纵难超越羲皇，亦可匹俦嵇阮。
温馨提示：
